Dekodiranje markera za hepatitis C

Hepatitis markeri su pojava različitih struktura bolesti. Riječ je o virusnoj bolesti koja je teško liječiti. Hepatitis utječe na probavne organe.

Laboratorijska dijagnoza

Liječnici razlikuju 2 oblika bolesti:

akutni - hepatitis B i A; kronični - hepatitis C.

Liječenje se provodi nakon pregleda bolesnika. Glavni način dijagnosticiranja hepatitisa C, B i A je proći krvne testove za virusne hepatitis markere. Proizvodnja imunoglobulina nastaje kada antigeni ulaze u ljudsko tijelo (jezgra, komponente, hepatitis B, C ili A omot). U početnoj fazi bolesti nastaju nespecifična protutijela. Zatim se određeni imunoglobulini proizvode u odgovarajuću komponentu virusa. Da bi dijagnosticirali bolest, liječnici ih koriste u razredima G i M. Ako se IgM detektira u krvi, tada se u tijelu pacijenta pojavljuje akutni proces. Klasi G imunoglobulini ukazuju na bolest. Takva antitijela glavni su kriterij za hepatitis E i A. Uz njihovu pomoć, liječnik može napraviti točnu dijagnozu. Glavni znakovi akutnog oblika liječnika su:

prisutnost površinskog antigena HbsAg; HBeAg protein; imunoglobulin anti-HBc.

Za otkrivanje hepatitisa C uzima se u obzir prisutnost sljedećih antigena:

HCV IgM; HCV jezgra IgM; HCV NS.

Za točnu dijagnozu liječnici provode sveobuhvatnu dijagnozu. Za otkrivanje virusnog hepatitisa B i C dešifriraju se protutijela, markeri i antigeni. Da biste dijagnosticirali akutni oblik, provedite sljedeće laboratorijske testove:

Ispitivanje krvi za markere; PCR.

Simptomi hepatitisa

S jakim imunitetom, akutni oblik bolesti završava potpunim oporavkom pacijenta. Ako bolest nastavi bez simptoma, tada se akutni oblik može pretvoriti u kroničnu fazu. U tom slučaju pacijent ima sljedeće simptome:

povećava jetra; bol sindrom; žutica; svrbež kože; slabost; mučnina; podrigivati.

Kronični stupanj bolesti dovodi do postupne smrti jetre. Stručnjaci za komplikacije uključuju cirozu. Simptomi hepatitisa C su izraženi 2-14 tjedana nakon infekcije:

slab apetit; slabost; poremećeni san; težina u trbuhu; osip.

Ovi simptomi pojavljuju se 1 tjedan. Onda dolazi icteric razdoblje. Cal dobiva svijetlu hladovinu. Postoji bol u zglobovima. Ovo razdoblje traje 3-5 tjedana. Dekodiranje rezultata može pokazati prisutnost neaktivnog virusa ili kroničnog oblika bolesti. Za točnu dijagnozu provodi se dodatni pregled:

ALT; kvantitativno PCR; biopsija.

Pomoću dekodiranja zadnjeg pregleda, liječnik određuje razinu jetrenih enzima, procjenjuje stupanj upalnog procesa. ALT i AST su hepatocitni enzimi. Ako su stanice oštećene, idu van. Uz pomoć transkripta za test krvi procjenjuje se razina hepatitisa, stupnja bolesti i stupnja oštećenja jetre. Ako je potrebno, upotrijebite neinvazivne metode za procjenu njegovog stanja.

U biopsiji jetre, stručnjak uzima iglu organa s tkivom (težina materijala 0,5 g). Za takav pregled koristi se lokalna anestezija. Materijal se proučava pod mikroskopom. Ovom analizom liječnik prima točne informacije o stupnju aktivnosti hepatitisa B.

Procjena rezultata

Tablica virusnih hepatitisa omogućuje otkrivanje odstupanja dobivenih podataka iz norme.

Pozitivni HBs ukazuju na prisutnost hepatitisa B i C. Ako je rezultat ispitivanja negativan onda nema HBV u krvi. Protutijela na površinski antigen su predstavljena u obliku zaštitnih struktura. Oni se proizvode kada se injektiraju u tijelo drugog antitijela. Pozitivan test pokazuje da je osoba zaštićena od virusa iz sljedećih razloga:

cijepljenje; kontrola samo-infekcije.

SAVJETI DOKTOR! Kako spasiti jetru ?!

Nikolaj Zakharov, izvanredni profesor, doktorirao, hepatolog, gastroenterolog

"Dnevne stanice dihidrokvermetina najjači su pomagači jetre u slučaju hepatitisa. Miniran je samo od smole i kora divljeg ariša. Znam samo jedan lijek u kojem je maksimalna koncentracija dihidrokverketin. Ovo je... "

Anti-HBc se proizvodi kao odgovor na prisustvo jezgrenog antigena u tijelu. Rezultat ovog testa ovisi o dekodiranju anti-HBs i HBsAg. Kada se dobije pozitivan rezultat, propisan je tijek liječenja (ako pacijent nije zaražen u prošlosti). Za otkrivanje akutne infekcije, provodi se IgM anti-HBc test. Pozitivan rezultat ukazuje na infekciju u tijelu pacijenta tijekom posljednjih 6 mjeseci ili na egzacerbaciju hepatitisa C.

Kod aktivnog oblika bolesti preporučuje se prolazak analize HBeAg. Ako je test pokazao pozitivan rezultat, pacijent je nositelj bolesti. Istodobno postoji visoka infektivnost krvi. Anti-HBe je protein koji se formira u ljudskom tijelu kao odgovor na E, antigen akutnog oblika bolesti.

Pozitivan rezultat ukazuje na razvoj niske hepatitis C aktivnosti uslijed niske razine HBV u krvi. Inače, u tijelu pacijenta započinje proces oporavka.

Pozitivan test HBV DNA ukazuje na aktivno umnožavanje virusa hepatitisa B. Pacijent je potencijalno opasno za druge ljude. Ako pacijent pati od hepatitisa C, pozitivan rezultat iz takve studije ukazuje na oštećenje jetre.

I nešto o tajnama...

Mnogi ljudi ne znaju da se hepatitis može izliječiti kod kuće!

Liječenje bolesti jetre je moguće bez kirurških zahvata, produženih tečajeva antibakterijskih i rehabilitacijskih terapija, itd.!

Da biste to učinili, potreban vam je alat s visokim sadržajem prirodnih dihidrokvermetina. Rezultat liječenja iznenađuje i iskusni liječnici. Žive stanice se miniraju samo od smole i kora divljeg ariša.

Naši čitatelji potvrdili su učinkovitost ove metode liječenja! Olga Krichevskaya ostavila je svoju recenziju o liječenju hepatitisa ovdje >>

Bolesti unutarnjih, vitalnih organa uvijek su zastrašujuća i često slabo podnosi tijelo. Osoba ima veću vjerojatnost da se obratite liječniku ako postoje vizualni simptomi (crvenilo, itd.), Ali hepatitis u početnim fazama nije asimptomatski. Prvi znakovi bolesti pojavljuju se kada bolest napreduje. Za dijagnozu su korišteni markeri virusnog hepatitisa. Da biste napravili analizu, morate se posavjetovati s liječnikom i uzeti uzorak krvi radi pregleda.

analize

Pomoću krvnih testova počinju dijagnostički postupci gotovo bilo koje bolesti. Dijagnostički postupak može uključivati ​​jedan ili više poznatih markera. U pravilu, standardna studija sastoji se od minimalnog broja pokazatelja. Ako je test pozitivan, dodaju se dodatne studije koje vam omogućuju određivanje ne samo prisutnosti, već i oblika i stadija bolesti.

Poseban oblik hepatitisa je autoimun. Tijekom razvoja bolesti, ljudsko tijelo otpušta posebna protutijela koja napadaju zdrave jetrene stanice. Uzrok ovog patološkog procesa je trenutno nepoznat. Štoviše, u 25% slučajeva, autoimuni hepatitis je potpuno asimptomatski i dijagnosticira se tek nakon početka ciroze jetre. ASMA i AMA koriste se kao markeri autoimunog hepatitisa. Oba tipa protutijela ili jedan od njih mogu se otkriti kod pacijenta.

Načini infekcije

Glavni način prijenosa hepatitisa je oralno-fekalna, što upućuje na to da je virus prisutan u fekalne mase zaraženih. Također je nužan kontakt zdrave osobe s otpadnim proizvodima pacijenta. Suprotno popularnom uvjerenju, možete dobiti hepatitis, ne samo tijekom posjeta toaletu. Ostaci virusa mogu se naći na rukohvatima javnog prijevoza, kućanskih predmeta, časopisa na javnim mjestima itd. Virus ulazi u ruke zdrave osobe, a zatim u usnu šupljinu. Stoga je važno promatrati higijenu i oprati ruke sapunom prije jela.

U zemljama koje imaju problema s pridržavanjem sanitarnih standarda, hepatitis može biti epidemiološki po prirodi i prenijeti kroz vodu.

Postoje i drugi načini infekcije:

Vrste bolesti B, C, D, G mogu se prenositi tijekom nezaštićenog seksa. Seksualno aktivni ljudi kao i spolni radnici su u opasnosti. Liječnici preporučuju testiranje za otkrivanje hepatitis markera svaka 3 mjeseca. U kirurškim zahvatima koji koriste krv koja je darovana, 2% biološkog materijala može sadržavati virus hepatitisa. Stoga, prije transfuzije, potrebno je provesti dodatna istraživanja materijala. Piercing, tetoviranje i drugi tretmani igala mogu nositi infekciju. Suvremena oprema i održavanje sanitarnih standarda u salonima pomaže u izbjegavanju širenja bolesti. Vertikalni način infekcije (od majke do fetusa u razvoju) rijetko se promatraju od strane liječnika. No, u slučaju kada je žena postala bolestan od akutnog oblika virusa u trećem tromjesečju, vjerojatnost infekcije fetusa značajno se povećava. U gotovo 40% slučajeva zaraze virusnim hepatitisom, izvor ostaje nepoznat.

Vrste A i E

Oblik tipa A, tip viralnog hepatitisa koji je najčešći. Ispitivanje krvi za markere virusnog hepatitisa tipa A treba obaviti nakon perioda inkubacije virusa. Prije pojave prvih simptoma bolesti, može potrajati od 7 do 50 dana. Međutim, ako je došlo do kontakta sa zaraženom osobom i postoji sumnja u prijenos virusa, liječnici preporučuju nekoliko studija u različito vrijeme.

Prva će se održati odmah, posljednja nakon maksimalnog razdoblja inkubacije.

Simptomi bolesti slični su prehladi, uz povećanje tjelesne temperature i zimice. Liječenje je obično uspješno, a bolest se ne uklanja brzo. Postoje i teški slučajevi kada pacijent zahtijeva hospitalizaciju i uvođenje posebnih lijekova za održavanje jetre, kao i smanjenje toksičnog učinka virusa.

Tip hepatitisa E je vrlo sličan u pojavi i simptomi tipa A. Često, dijagnostika koristi markere kako bi identificirala obje vrste za preciznu identifikaciju virusa. Hepatitis E je ozbiljniji i vrlo opasan kod žena u trudnoći. Sljedeći se markeri koriste za dijagnozu.

IgM anti-HAV. Ova vrsta antitijela se proizvodi kada se tijelo aktivno bori protiv virusa A. Dijagnosticiran je akutni oblik bolesti. IgG anti-HAV. Vrsta G protutijela su prisutna u pacijentovom tijelu ako je imao bolest ili ako je hepatitis postala kronična. IgM anti-HEV. Posebna vrsta antitijela koja odgovara akutnom virusnom hepatitisu E. IgG anti-HEV. Uspješno izliječeni ili kronični oblik hepatitisa E.

Vrste B i D

Hepatitis B biljezi se koriste za dijagnosticiranje akutnih i kroničnih oblika bolesti. Prijenos hepatitisa B može se pojaviti od pacijenta do pacijenta tijekom seksualnog kontakta. Također, ova virusna bolest prenosi se krvlju. Infekcija od majke do fetusa, prijenos virusa kroz injekcije, itd. Su moguće. Simptomi bolesti započinju blago oboljenje, groznica, bol u zglobovima.

Zatim se stanje pogoršava, javlja se slabost, mučnina i povraćanje.

Istraživanje hepatitisa D markera često se propisuje zajedno s analizom tipa B. Viralni tip D je vrsta satelita druge vrste bolesti koja komplicira liječenje i izaziva razvoj komplikacija. Za dijagnostiku se koristi nekoliko jedinstvenih vrsta markera. Rezultati dekodiranja prikazani su u tabličnom obliku.

Laboratorijska dijagnoza hepatitisa C

MI Mikhailov, Institut za epidemiologiju i mikrobiologiju. N.F. Gamalei RAMS, Moskva

Pri dijagnosticiranju "hepatitisa C" potrebno je uzeti u obzir sljedeće najvažnije čimbenike:

  • pokazatelji aktivnosti enzima "jetre";
  • prisutnost ili odsutnost markera infekcije virusom hepatitisa C (HCV) i drugih hepatotropnih virusa;
  • podaci epidemiološke povijesti;
  • rezultati kliničkog ispitivanja pacijenta. Samo iscrpan prikaz ovih čimbenika omogućava dijagnozu ove bolesti s visokim stupnjem pouzdanosti. Laboratorijski radnik mora pružiti objektivne informacije o identificiranom spektru virusnih antigena i antitijela, kao i HCV RNA, čime kliničar, djelatnik za transfuziju krvi i epidemiolog mogu riješiti svoje probleme. Najčešće je:
  • identificiranje osoba s HCV-om radi smanjenja razine posttransfuzijskog hepatitisa C;
  • dijagnoza i razlika između akutnog i kroničnog hepatitisa C;
  • prognozu bolesti;
  • imenovanje, procjenu i prognozu učinkovitosti terapije;
  • proučavanje širine širenja HCV u populaciji i različitim skupinama stanovništva.
    U ovom slučaju glavna područja rada koje obavlja laboratorijsko osoblje su:
  • razvoj i odabir najpoznatijih metoda za prepoznavanje markera HCV infekcije;
  • utvrđivanje kriterija za objektivnu procjenu dobivenih rezultata;
  • razvoj optimalnih laboratorijskih algoritama;
  • implementacija sustava za poboljšanje kvalitete otkrivanja biljega HCV infekcije.

    Osnova laboratorijske dijagnoze hepatitisa C je poznavanje HCV-a, njezina replikacija, informacije o dinamici nastanka i nestanka markera infekcije, kao i moderne imunokemijske i molekularno-biološke metode za otkrivanje antigena, protutijela i nukleinskih kiselina.

    Virus hepatitisa C. HCV je prvi put identificiran 1988. godine kada je skupina istraživača na čelu s M. Houghtonom i Choo Q.L primijenila nove molekularno-biološke metode istraživanja, klonirala i sekvencirala virusni genom [I]. Čestica virusa hepatitisa C ima sferični oblik s prosječnim promjerom od oko 50 nm [2,3]. Pokušaji vizualnog otkrivanja i proučavanja strukture virusa hepatitisa C su napravljeni od otkrića virusa, ali još uvijek nema dobro dokumentiranih rezultata tih studija, što može biti posljedica poteškoća akumuliranja čestica virusa u potrebnim količinama.

    VGS je jedini član Hepacivirus rodova u obitelji Flaviviridae koji uključuje viruse kao što su virusni proljevni virus i svinjska groznica (Pestivirus genus) i virus žute groznice, Denge virus i GB virusi: GBV-A, GBV-B i GBV-C / HGV (roda Flavivi-rus). Struktura virusa hepatitisa C može se prikazati kako slijedi (shema br. 1). Nukleokapsid sadrži RNK virusa hepatitisa C. Odozgo, nukleokapsid je obložen lipidnom membranom, u kojem su obuhvaćene envelopirane proteine ​​kodirane HCV RNA. Virusni genom predstavlja jednostranu linearnu RNA molekulu pozitivne polarnosti, duljine oko 9.600 nukleotida. Organizacija HCV genoma slična je ostalim flavivirusima. Razlikuje dvije zone koje kodiraju strukturne i ne-strukturne (funkcionalne) proteine. Geni koji kodiraju strukturne proteine ​​nalaze se u 5 'regiji viralnog genoma, a ne-strukturni u 3' regijama. HCV gen ima jedan otvoreni okvir za čitanje (ORS), jedan polipeptid (približno 3000 aminokiselina), koji se virusnim i staničnim proteazama izrezuje u strukturne i ne-strukturne proteine.

    Sl. 1. Strukturni elementi HCV

    Strukturne bjelančevine uključuju proteine ​​koji su kodirani jezgrom jezgre, El i E2 HCV RNA. Otkrivena su tri oblika HCV C-proteina: full-length (p21) molekularne težine 21 kD, skraćeno (p19) i oblik (p16) koji su pronađeni u nukleolima zaraženih hepatocita. Na njegovoj površini, C-protein nosi različite visoko očuvane epitope B stanica, čija je postojanost iznimno važna za otkrivanje protutijela na HCV u procesu laboratorijske dijagnoze hepatitisa C.

    HCV RNA zone E1 i E2 kodiraju proteine ​​molekulske mase 31 i 70 kD. Ovi proteini imaju nekoliko N-glikozilacijskih mjesta; u E1 proteinu, definira se do 6 takvih mjesta, au E2-11. U sekciji E2 nalaze se informacije o malom proteinu - p7, koji se ne nalazi u strukturi virusa.

    Određivanje područja koja se nalaze bliže 3'-kraju HCV RNA - kao zone koje nose informacije o ne-strukturnih proteina virusa, ukazuje na to da ti proteini nisu strukturne komponente virusne čestice. U nestacionarnoj zoni HCV RNA, nalaze se sekcije: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B. Većina proteina kodiranih nestrukturnim zonama HCV RNA potrebna je za replikaciju virusa.

    Komparativna analiza nukleotidnih sekvenci RNA izolata HCV dobivenih u različitim regijama svijeta, pa čak i tijekom bolesti od istog pacijenta, otkrila je glavnu značajku ovog virusa - visoku heterogenost RNA. Položaj značajne genetske varijabilnosti HCV RNA stvorio je osnovu za teoriju koja objašnjava: dugoročni (ponekad životni vijek) prijevoza virusa, česti razvoj kronične bolesti, poteškoće u terapiji i stvaranje učinkovitih cjepiva. Najznačajnije razlike u sekvencijama HCV RNA koncentrirane su u N-terminalnom dijelu E2 područja, koja je označena kao "hipervarijabilna regija" (HVR) [4].

    Trenutno je identificirano 6 glavnih genotipova i više od 100 HCV podtipova. Genotipovi 1a, lb, 2a, 2b, 2c i Za predstavljaju više od 90% HCV izolata dobivenih u Sjevernoj i Južnoj Americi, Europi, Rusiji, Kini, Japanu i Australiji / Novom Zelandu [5]. Genotipovi 4, 5a i 6 zabilježeni su u srednjoj i južnoj Africi, te u jugoistočnoj Aziji. U Rusiji i zemljama ZND-a prevladava dominantnost genotipa 16 (ne manje od 68,9%) [6,7]. Vjeruje se da pacijenti zaraženi genotipom 1 (osobito 1b) reagiraju na liječenje nego bolesnici zaraženi drugim genotipima virusa.

    Kod bolesnika, HCV cirkulira kao populacija virusnih čestica kod kojih se genomi razlikuju od 1-2% (kvazi-specifičnosti) kao rezultat mutacija koje se akumuliraju tijekom infekcije i / ili ušli u pacijenta tijekom infekcije. Ovi mutirani oblici mogu pridonijeti aktivnijoj replikaciji ili mogu pomoći virusu izbjegavanju imunološkog odgovora tijela i potencijalno utjecati na ishod akutne infekcije, razlike u tijeku bolesti i odgovor na terapiju interferonom [8].

    DEFINICIJA ANTI-HCV. Nakon otkrića HCV virusa i utvrđivanja njegove uloge u razvoju posttransfuzijskog hepatitisa - "ni A niti B", istraživači su bili zaduženi za razvoj metoda sposobnih za otkrivanje osoba s HCV i pogodnim za dijagnosticiranje akutnog i kroničnog hepatitisa C. Utvrđeno je da HCV antigeni cirkuliraju u izuzetno niske koncentracije, i očito je da je metodološka razina kasnih 80-ih godina 20. stoljeća, koja se koristila za otkrivanje virusnih antigena, očito nedovoljna.

    Godine 1989. skupina istraživača iz Chiron Corporation, pod vodstvom Q-L.Choo, klonira HCV RNA i dobiva imunoreaktivne oligopeptide koji reagiraju s antitijelima koji cirkuliraju u krvi pacijenata s kroničnim hepatitisom "ni A ni B". Ovi oligopeptidi postali su temelj dijagnostičkih lijekova za otkrivanje protutijela na HCV. To je odredilo brz napredak u razvoju i komercijalnoj proizvodnji dijagnostičkih proizvoda. Glavna metoda koja se koristi za otkrivanje anti-HCV postala je enzimski povezani imunosorbentni test, kao metoda koja zadovoljava zahtjeve praktične zdravstvene zaštite - tj. Ima visoku osjetljivost, specifičnost i jednostavnost implementacije.

    S obzirom na to da HCV nastavi u krvi pacijenata s akutnim i kroničnim hepatitisom C istodobno s anti-HCV, pažnja razvijen od strane dijagnostičkih lijekova bila je usredotočena na razvoj testnih sustava za otkrivanje antitijela koja pružaju najpotpuniju detekciju nosača virusa i najraniju moguću dijagnozu akutne infekcije. Raznolikost antigena i antigenskih determinanti kodiranih strukturnom i nestacionarnom zonom HCV RNA odredila je smjer dizajna dijagnostičkih proizvoda odabirom i uređivanjem oligopeptida korištenih za njihovo stvaranje. Tijekom vremena koje je prošlo otkriće HCV, stvoreni su dijagnostički sustavi od tri generacije (Tablica 1).

    Tablica 1
    Dijagnostički pripravci za otkrivanje anti-HCV [9]

    Koristi se peptidi
    zona HCV RNA u kojoj
    oni su kodirani

    % detekcije nositelja
    HCV

    Prvi put
    otkrivanje
    anti - HCV iz
    početak žutice

    5-1-1 NS3
    C100-3 NS4

    C22-3 jezgra
    C200 NS3 i NS4
    SZZs NS3
    Od 100-3 NS4

    C22-3 jezgra
    C200 NS3 i NS4
    SZZs NS3
    Peptid NS5

    Uvođenje dodatnih peptida, prvenstveno c22-3 (Core), u dijagnostičke pripravke 2. i 3. generacije dopušteno je riješiti glavni problem, odnosno povećati osjetljivost, specifičnost i, najvažnije, detekciju anti-HCV. Zahvaljujući dijagnostici treće generacije može se otkriti do 97% HCV nosača. Istodobno, određena diskusija uzrokovana je odlukom da se uvede u dijagnostički peptid kodiran NS5 regijom HCV RNA. Prema nekim istraživačima, prisutnost ovog peptida nije kritična za poboljšanje kvalitete dijagnostičkog lijeka. [10,11]. Međutim, protutijela NS5 mogu se ranije otkriti u infekciji, što poboljšava kvalitetu laboratorijske dijagnoze akutnog hepatitisa C. [12].

    Trenutno se u cijelom svijetu, uključujući Rusiju, koriste dijagnostički proizvodi treće generacije. Peptidi korišteni u dijagnostičkim pripravcima dobiveni su pomoću rekombinantne tehnologije (na primjer, dijagnostički testovi tvrtki: Dijagnostički pripravci Nizhny Novgorod, Vector, Novosibirsk, Roche, Abbott itd.) Ili sintetički ( 000 MTS "Avicenna", Sankt Peterburg, "Organon" itd.). Dijagnostici, u kojima su istovremeno korištene obje vrste peptida, označene su kao lijekovi četvrte generacije. Prema njihovim svojstvima, ti lijekovi nemaju značajne razlike. Usporedni testovi koje je redovito proveo Ministarstvo zdravstva Rusije pokazali su usporedivu osjetljivost dijagnostičkih proizvoda domaćih i stranih proizvođača.

    Utvrđeno je da se upotreba dijagnostike treće generacije za otkrivanje anti-HCV u imunokompetentnoj populaciji (na primjer, donora krvi) procjenjuje na 98,8-100%. Istodobno, među imunokompromitiranim pojedincima, kao što su bolesnici nakon transplantacije bubrega, koštane srži ili osoba zaraženih HIV-om, ova je brojka znatno niža - 50 - 95% [12]. S.George i sur. [13] pokazala je da u 8,4% pacijenata s HIV infekcijom bilježe lažno negativni rezultati anti-HCV detekcije. Štoviše, kod takvih bolesnika može se registrirati učinak serumeversije tijekom promatranja, tj. registracija pozitivnog rezultata nakon seronegativnog anti-HCV razdoblja [14].

    Jedan od najvažnijih problema u provođenju istraživanja za prisutnost anti-HCV je lažno pozitivan rezultat. Njihov izgled može biti posljedica nespecifične interakcije reakcijskih komponenti, mogućih križnih reakcija s drugim virusnim antigenom i mnogih drugih čimbenika. Razina lažno pozitivnih rezultata u otkrivanju anti-HCV s različitim dijagnostičkim lijekovima može doseći 10-20% [15,16]. Povećana razina takvih rezultata zabilježena je kod bolesnika s onkološkim i autoimunim bolestima, osoba s imunodeficijentnim stanjima i bolesnika sifilisa [16,17]. Postojanje lažno pozitivnih rezultata suočava se s laboratorijskim radnikom s zadatkom da ih razlikuje od istinskog otkrivanja anti-HCV. Da bi se riješio taj problem je otkrivanje serumske HCV RNA u uzorku krvi. Međutim, negativni rezultat otkrivanja HCV RNA ne sugerira prisutnost lažno-pozitivne detekcije anti-HCV. Treba imati na umu da anti-HCV može cirkulirati izolirano u krvi pacijenta koji se oporavio od akutnog hepatitisa C (10-15%) ili koji je eliminirao HCV RNA kao rezultat terapije.

    POTVRDA (DODATAK) ISPITIVANJA. Dodatni (dopunski) testovi razvijeni su kako bi se razlikovali lažni pozitivni uzorci i uzorci koji zapravo sadrže protutijela na HCV. Najčešće u tim testovima koristi se princip imunoblota (na primjer, RIBA test ("Ortho-Clinical Diagnostics"); "LiaTek HCV" (Organon Teknika) kada su antigeni kodirani različitim zonama HCV RNA adsorbirani na nitroceluloznoj membrani na nitroceluloznoj membrani. Anti-HCV reagira s adsorbiranim antigenima upotrebom antitijela obilježenih enzimima protiv humanog IgG i njihovom naknadnom detektiranjem upotrebom kompleksa supstrata. Osim imunoblota, kao dodatna ispitivanja koriste se i dijagnostički pripravci za detekciju anti-HCV protiv specifičnih antigena kodiranih različitim zonama HCV RNA ["Spectrum 4" (Imbio, Nizhny Novgorod; RecombiBest ANTI-HCV-SPECTR) - Vektor Best ", Novosibirsk, ELISA-Anti-NSU-Spectr, NPO" dijagnostički sustavi ", Nizhny Novgorod].

    Razvoj i provedba ovih testova ide ruku pod ruku s uvođenjem testova screeninga za otkrivanje anti-HCV, ponovivši princip širenja spektra peptida koji se koriste u svakoj naknadnoj generaciji dijagnostičkih proizvoda. Dakle, dijagnostički RIBA-III se razlikuje od prethodne generacije dodavanjem peptida koji je kodiran NS5 zonom. Načela za potvrđivanje pozitivnog otkrivanja anti-HCV-a uključuju prvenstveno mogućnost (u nekim slučajevima) za dobivanje točnijih rezultata enzimske reakcije u interakciji s pojedinačnim peptidima, kao i korištenjem proširenog spektra peptida u dijagnostici koji se ne koriste u testovima screeninga. Samo uvođenje novih peptida može povećati dijagnostičku vrijednost potvrdnih testova.

    Tumačenje dobivenih rezultata, na primjer, u testu kao što je RIBA-III, uključuje tri moguća odgovora: pozitivan, negativan i neizvjestan rezultat. Posljednji od njih je izdan u slučaju nepostojanja jasnih indikacija (prema uputama priloženim dijagnostičkom kompletu), što vam omogućuje da svakako procijenite prisutnost ili odsutnost anti-HCV u uzorku koji se istražuje. Omjer spektra snimljenih odgovora prilikom provođenja potvrđenih testova varira ovisno o karakteristikama skupina pacijenata kod kojih se prvenstveno otkriva anti-HCV [18]. Prema J.M. Pawlotsky i sur. [19], u polovici rezultata koji su tretirani kao "nespecificirani", moguće je detektirati HCV RNA. Prema našem mišljenju, legitimitet odgovora - "neizvjestan rezultat otkrivanja anti-HCV", koji je laboratorij izdao kliničaru, vidljivo je ne samo u provođenju potvrđivanja testa, nego i rutinski testiranje na prisutnost anti-HCV. Potreba za takvim tumačenjem rezultata je odraz trenutnog stanja laboratorijske dijagnoze hepatitisa C.

    ODREĐIVANJE IgM ANTI-HCV. Trenutno su stvorene dijagnostičke komplete za otkrivanje IgM anti-HCV od strane tvrtki koje se komercijalno proizvode: "Vector Best"; "Dijagnostički sustavi"; Imbio, Abbott i dr. U fazi projektiranja dijagnostičkih kompleta stvoreni su ELISA kompleti, zasnovani na peptidima kodiranim različitim područjima HCV RNA [20]. Izbor je napravljen na peptidu koju kodira jezgra regije HCV RNA i otkrivanje IgM protutijela na njega. Kao i kod uporabe testova za otkrivanje anti-HCV (IgG), lažno pozitivne rezultate mogu se zabilježiti u IgM anti-HCV testu. Prema Stevensona D.L. et al. [21], do 70% bolesnika s kroničnim hepatitisom C s prisutnošću anti-HCV IgM istodobno je imalo povećanu razinu reumatoidnog faktora što pridonosi pojavi lažno pozitivnih rezultata. Međutim, prema Pawlotsky J.M., prisutnost reumatoidnog faktora ne utječe na kvalitetu detekcije IgM anti-HCV [22].

    ODREĐIVANJE HCV ANTIGENA. Sposobnost otkrivanja HCV antigena privukla je pozornost istraživača odmah nakon otkrića virusa. Glavnu mogućnost njihova ispitivanja pokazala je K. Krawczynski i suradnici [23], koji imunohistokemijski detektiraju HCV antigene u jetrenom tkivu, dokazujući specifičnost imunofluorescentnog sjaja. Korištenje poli- i monoklonskih antitijela na razne HCV antigene otkrilo je prisutnost jezgre Ag HCV, antigena kodiranih NS3 i NS4 zona HCV RNA u hepatocitnoj jezgri i citoplazmi u 60-90% bolesnika s kroničnim HS) [24]. HCV antigeni mogu se detektirati u manje od 5% stanica jetre.

    Prvi dijagnostički testni sustavi ("Ortho Antibody to Core Antigen (mišji monoklonski) EL1SA testni sustav" i "Imucheck F-HCV Ag Core Kokusai") za otkrivanje HCV antigena pojavljuju se na tržištu za imunobiološke pripravke 1999. godine. Cilj za detekciju bio je Core antigen HCV, koji se određuje pomoću ELISA varijante krute faze dizajnirane na osnovi monoklonskih protutijela. Prve studije o korištenju ovih testova odredile su njihovu veliku osjetljivost, specifičnost i izglede primjene, prije svega u službi za transfuziju krvi [25,26]. osnovana:

  • sposobnost određivanja Core Ag HCV u serumu ili plazmi;
  • specifičnost detekcije Core Ag HCV;
  • prisutnost osoba s cirkulirajućim antigenom u seronegativnom serumu za anti-HCV;
  • česte (90,3%) detekcije Core Ag HCV u serumu uz prisustvo anti-HCV i HCV RNA [25];
  • izravna korelacija između koncentracije HCV RNA i detekcije Core Ag HCV [25];
  • kontrakcija faze "prozora" - od trenutka infekcije do prvog pozitivnog rezultata otkrivanja anti-HCV. Utvrđeno je da se Core Ag HCV može otkriti u 83% slučajeva (n = 24) sljedećeg dana nakon prve detekcije HCV RNA [26] i dugog (26 dana u prosjeku) prije pojave anti-HCV [27].

    METODE DETEKCIJE HCV RNA. Suvremena faza laboratorijske dijagnoze hepatitisa C može se karakterizirati kao stupanj početka širokog korištenja molekularnih bioloških metoda za otkrivanje HCV RNA. Velika većina metoda za otkrivanje nukleinske kiseline testirana je za otkrivanje HCV RNA. Značajna količina pregleda literature objavljena kako u ruskom [28] tako iu stranim publikacijama [29] posvećena je načelima oblikovanja dijagnostičkih proizvoda i njihovoj uporabi za otkrivanje virusne DNA ili RNA. Sve ove metode se mogu podijeliti u dvije skupine, koje se temelje na primjeni načela hibridizacije bez pojačanja odabranog dijela nukleinske kiseline ili njihovom amplifikacijom, što može značajno povećati razlučivost metode.

    Metoda hibridizacije temelji se na kombinaciji obilježenih hibridizacijskih sondi (genetskog inženjerstva ili sintetičkih molekularnih struktura koje sadrže nukleotidne sekvence koje su komplementarne odabranim sekcijama RNA). Analiza rezultata provodi se prema intenzitetu signala koji dolazi iz oznake u sastavu formiranog kompleksa.

    U hepatitisu C, ova metoda detekcije HCV RNA prvenstveno je korištena da bi se identificirala izravno u hepatocitima, te u testovima koji se nazivaju in situhibidizacija [30]. Mogućnost izravnog otkrivanja HCV RNA u tkivu omogućila je njegovo otkrivanje u mononuklearnim krvnim stanicama, stanicama žlijezda slinovnica i ostalim tkivima tijela pacijenta s hepatitisom C [31,32].

    Hibridizacijska metoda koja se koristi za detekciju HCV RNA omogućuje da se pokaže prisutnost negativnih (replikativnih) lanaca HCV RNA, što ukazuje na aktivnu replikaciju virusa [33].

    Metoda lančane reakcije polimeraze je trenutno najčešće korištena metodička tehnika koja se temelji na gotovo svim molekularnim biološkim metodama za otkrivanje HCV RNA. Štoviše, određivanje HCV RNA moguće je iu kvalitativnom i kvantitativnom obliku što je osobito važno za imenovanje, praćenje i procjenu učinkovitosti primijenjene terapije.

    Glavne varijante metode su:

  • lančana reakcija polimeraze (PCR);
  • ligaza lančana reakcija;
  • NASBA;
  • TMA (transkripcija-posredovana amplifikacijska reakcija, transkripcija posredovana amplifikacija).

    Lančana reakcija polimeraze široko je korištena metoda detekcije HCV RNA, kako u Rusiji tako iu inozemstvu. Temelji se na procesu s više ciklusa, nalik prirodnoj replikaciji nukleinske kiseline, pri čemu svaki ciklus se sastoji od uzastopnih stadija.

    Iz ispitivanog materijala (serum ili krvna plazma, biopsija jetre) izolira se HCV RNA. S obzirom da je HCV nukleinska kiselina predstavljena s RNA i molekula cDNA potrebna za amplifikaciju, koristeći enzimsku reverznu transkriptazu, javlja se stvaranje jednolančanih HCV cDNA molekula. U sljedećoj fazi, takozvani "HCV" su vezani za određeni dio svakog od HCV cDNA lanaca primeri su kratki oligonukleotidi komplementarni poznatim nukleotidnim sekvencama. Usporedba primarne strukture 5'UTR regije genoma različitih izolata HCV otkrila je njihovu neznatnu varijabilnost (između genotipova, homologija nukleotida - 92-98% i unutar genotipa 98-99%). Time je bilo poželjnije odabrati primere iz ove zone HCV RNA i njihovu upotrebu u dijagnostičkim testnim sustavima proizvedenim u našoj zemlji i inozemstvu.

    Nadalje, uz pomoć enzima DNA-ovisne DNA polimeraze, dolazi do sinteze novih DNA segmenata. Trenutno su bakterije Thermophilus termus (Tth polimeraza) ili Thermophilus aquaticus (Taq polimeraza) najčešće korištene kao izvor ovog enzima. Posjedujući toplinsku stabilnost u prisutnosti mangana i magnezijeva iona, ovaj enzim može se istovremeno koristiti za sintetizaciju komplementarnih jednolančanih HCV cDNA molekula i pojačavanje odabranih cDNA regija. U završnoj fazi jednog ciklusa reakcije, korištenjem DNA polimeraze, odvija se sinteza novih lanaca komplementarnih HCV cDNA. Višekratno ponavljanje reakcijskih ciklusa dovodi do nakupljanja HCV cDNA fragmenata, koji se može registrirati pomoću elektroforeze poliakrilamidne kiseline praćeno vizualnom detekcijom ili hibridizacijom s oligonukleotidnim probe, što povećava osjetljivost i specifičnost upotrijebljenih dijagnostičkih proizvoda. Upotreba primera obilježenih enzimima omogućuje snimanje PCR rezultata pomoću enzimskog imunotestiranja.

    Stalni cilj za istraživače koji oblikuju dijagnostičke sustave za otkrivanje HCV RNA je povećanje osjetljivosti i specifičnosti. Ovaj cilj poslužuje se PCR varijantom, nazvanim "nested PCR" (ugniježđena PCR) [34]. Značajka ove metode iz "klasičnog" je istodobna upotreba dva para osnovica, od kojih je jedan komplementaran unutarnjem dijelu ampikona dobivenog nakon prvog kruga amplifikacije. Istodobno, vjeruje se da s ovom PCR varijantom postoji veći rizik kontaminacije uzoraka, što može dovesti do lažnih pozitivnih rezultata [35].

    Akutna potreba za određivanjem HCV RNA i poteškoće povezane s velikim proizvodnjom visoko osjetljivih i specifičnih dijagnostičkih kompleta za PCR dijagnostiku odredili su široku primjenu pripravaka u znanstvenim laboratorijima. Usporedba tih ispitnih sustava, tzv. "Home" testovi ("in house tests"), pokazala je veliku varijabilnost osjetljivosti i specifičnosti, kao i nedostatak ponovljivosti rezultata između laboratorija i niza dijagnostičkih proizvoda. Dakle, pri provedbi prvog europskog ciklusa "eksterne" kontrole kvalitete za otkrivanje HCV RNA (1996) iz 136 laboratorija, samo 22 (16%) bilo je u stanju točno odrediti prisutnost ili odsutnost virusne RNA u danim kontrolnim uzorcima [36]. Sličan rezultat zabilježen je u našoj zemlji tijekom sličnog rada u saveznom sustavu vanjske kontrole kvalitete (2001), kada je od 14 sudionika u laboratoriju samo 3 (21,4%) bilo u stanju ispravno riješiti zadatak [37].

    Razlozi za pojavu lažno negativnih i lažno pozitivnih rezultata otkrivanja HCV RNA su različiti. Za lažne negativne rezultate:
    - gubitak ili uništavanje HCV RNA u pripremi za odgovor kliničkog materijala;
    - prisutnost u uzorku inhibitora koji utječu na različite komponente PCR-a. Ovi inhibitori predstavljaju različite kemijske ili proteinske tvari. Na primjer: prisutnost u spermijskoj tekućini inhibitora reverzne transkriptaze nije dopustila otkrivanje HCV RNA i razgovor o mogućnosti realizacije seksualnog prijenosa hepatitisa C [38]; prisutnost hepaprine [39]; visoke razine serumske krioglobuline [40];
    - nepoštivanje toplinske skladištenja i transporta kliničkog materijala. Za lažne pozitivne rezultate:
    - kontaminacija između uzoraka (pri obradi uzoraka i / ili radnji s reakcijskom smjesom), uključujući onečišćenje s pozitivnim kontrolnim uzorkom;
    - onečišćenje s proizvodima za pred-amplifikaciju (amplicons) koji mogu zagaditi testne uzorke i otopine pomoću aerosola ili laboratorijske opreme.

    Masivno uvođenje PCR dijagnostike definiranjem HCV RNA postavilo je zadatak prelaska na novu razinu laboratorijskih istraživanja za zdravstvene vlasti. Izolacija izoliranih zona za provedbu glavnih faza PCR (za pripremu uzorka, pojačanje, uzeti u obzir dobivene rezultate); zasebni kit za svaku fazu reakcijske laboratorijske odjeće, automatske pipete; postojanje standardnih dijagnostičkih kompleta i, što je najvažnije, prisutnost visoko kvalificiranog laboratorijskog osoblja smanjuje pojavu lažnih rezultata.

    Prvi standardizirani komplet za određivanje HCV RNA ("Amplicor ™ HCV", "Roche Diagnostic Systems") proizveden je 1993. godine. Tijekom godina razvili su se HCV RNA setovi, čija je glavna svrha povećati njihovu osjetljivost i specifičnost. Kod izrade Amplicor TM HCV korištene su nekoliko izvornih metoda za identificiranje 100 ili više kopija HCV RNA po ml., Kao i za rješavanje mogućih slučajeva kontaminacije uzoraka i otopina korištenih u kompletu. Korištenje enzimske amperses i delsiuridin triphosphate (dUTP) omogućava uništavanje u prvom ciklusu amplifikacije prethodnih aplicona s kojima se može pojaviti kontaminacija. Uništavanje amplifikacije na kraju prvog ciklusa pojačanja (pri +55 ° C) ne dopušta enzimu da uništi amplikone odabrane kao ciljeve. Glavna inovacija bila je uvođenje interne kontrole. Značenje ove inovacije leži u uvođenju sekvence slične pojačanom području HCV RNA u svaki testni uzorak, koji se naknadno detektira primjenom odgovarajućih početnica u reakciji amplifikacije u sličnom postupku. Odsutnost pozitivne reakcije u otkrivanju interne kontrole ukazuje na prisutnost lažno negativnog rezultata reakcije na prisutnost HCV RNA u ispitivanom uzorku. Sljedeća generacija je dijagnosticirana lijekom, nazvanim "HCV Amplicor 2.0", koji, kada se koristi, ima granicu osjetljivosti 50 HCV RNA molekula.

    Sustav za otkrivanje HCV RNA korištenjem Rocheovih kompleta ne može se uzeti u obzir izolirano od njihove instrumentacije, što određuje visoku kvalitetu ispitivanja. Programeri metode nastojali su potpuno automatizirati sve faze reakcije. Utjelovljenje ove ideje bila je sustav "COBASAmpliPrepTM", koji vam omogućuje potpunu automatizaciju procesa izolacije HCV RNA, pojačanja i detekcije, čime se smanjuje rizik od lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata, uz održavanje visoke osjetljivosti i specifičnosti [41].

    Lančana reakcija ligaze za detekciju HHC RNA (LCR). Metoda se temelji na sposobnosti enzima "DNK DNA koja ovisi o DNA" da se šavne (ligira) prekide fosfodiesterske veze u DNA u prisutnosti ATP i Mg 2+ iona. Kao i kod "klasičnog" PCR-a za otkrivanje HCV RNA, prva faza LCR-a je reverzna transkripcija da se dobije HCV cDNA. Nadalje, DNK ligaza veže dva para para (komplementarna 5 'neododiranoj zoni HCV RNA), koja se dalje pojačavaju. Detekcija produkata amplifikacije LCR provodi se uzimanjem u obzir reakcije antigenskih antitijela. Svaka od dva primera označena je različitim haptenom. Prvi od njih zarobljen je antitijelima adsorbiranim na mikročesticama. Nakon postupka pranja pomoću drugog para protutijela obilježenih fluorescentnom oznakom, selektivno su u interakciji s haptenom u proizvodu za amplifikaciju, nakon čega slijedi reakcija supstrata i računanje na fluorimetar.

    Osjetljivost ove metode je oko 200 kopija HCV RNA po ml, što omogućuje njegovu uporabu za rješavanje različitih kliničkih dijagnostičkih problema [42]. Trenutno, dijagnostičke komplete za otkrivanje HCV RNA temeljene na LCR-u proizvodi Abbott.

    Amplifikacija sumnjivih nukleinskih kiselina - NASBA metoda za detekciju HCV RNA temelji se na istovremenom djelovanju tri enzima: reverzna transkriptaza ptičjeg mijeloblasta, ptičje RNAaze i T7 RNA polimeraze [43]. Za razliku od RT PCR, prvi korak ne obnavlja transkripciju HCV RNA. Koristeći upotrijebljene enzime, u roku od 90 minuta može se dobiti više od 10 (9) kopija HCV cDNA regije [44]. Mogućnost provođenja reakcije pri niskim temperaturama (+ 41 ° C) uvelike pojednostavljuje rad i uklanja potrebu za opremom koja omogućuje cikličke promjene u visokim temperaturama. Zapisi rezultata reakcije provode se pomoću elektrokemiluminescencije. Unatoč činjenici da je NASBA blizu RT PCR-a u svojoj osjetljivosti, metoda nije široko korištena za otkrivanje HCV RNA. Trenutno se razvija varijanta metode koja kombinira principe NASBA i "real-time RT PCR".

    Transkripcijsko posredovano pojačanje (TMA) metoda razlikuje se od PCR i LCR prvenstveno zato što izravno pojačava fragmente HCV RNA, a ne HCV cDNA. U početnoj fazi reakcije, primer (br. 1) je vezan na HCV RNA i kopija ciljne molekule, cDNA, sintetizirana je pomoću enzima (reverzna transkriptaza). Reversna transkriptaza, koja također ima aktivnost RNaze-H, uništava virusnu RNA u hibridnoj RNA-cDNA. Zatim je pričvršćen drugi premaz za cDNA molekulu, nakon čega slijedi završetak dvolančane DNA pomoću reverzne transkriptaze. Uz pomoć drugog enzima β-RNA polimeraze, RNA se transkribira iz cDNA, što dovodi do formiranja 100 do 1000 kopija amplicona HCV RNA u jednom reakcijskom ciklusu. Primer br. 2 je vezan za ove aplicone RNA uz daljnju sintezu cDNA kopija i uništavanje molekule RNA. Pričvršćivanje primera br. 1 u cDNA nakon čega slijedi završetak dvolančane DNA aktivira sljedeći ciklus amplifikacije. Snimanje rezultata reakcije provodi se na lumenometru, budući da su dobivene RNA amplikone specifično u interakciji s DNA sondama obilježenim kemiluminima.

    Kao prednosti TMA metode u otkrivanju HCV RNA, zabilježeno je:

  • provođenje reakcije na nižim temperaturama u usporedbi s PCR;
  • formiranje većeg broja amplikona u jednom reakcijskom ciklusu, što smanjuje vrijeme potrebno za dobivanje konačnog rezultata (30-40 minuta) i povećava osjetljivost reakcije (50 kopija / ml) [45].
  • smanjujući rizik kontaminacije, budući da je RNA manje stabilna od DNA.

    Usporedne studije o otkrivanju HCV RNA pomoću TMA i drugih metoda pokazale su visoku razinu podudarnosti rezultata [45].

    Kombinacija načela hibridizacije i amplifikacije podrazumijeva metodu detektiranja HCV RNA, označenu kao "Metoda hibridizacije pomoću razgrananih probe ili markiranog DNA testa (bDNA)" [46]. Za razliku od PCR, ovaj test ne pojačava molekule HCV cDNA, već signal. Reakcija se provodi u pločicama s 96 jažica na kojima se adsorbiraju fragmenti HCV RNA iz 5 'netranslatirane zone i HCV RNA jezgreni gen, zbog naknadnog vezanja na sintetsku razgrananu DNA molekulu i hibridizacije s uzorkom obilježenim s alkalnom fosfatazom s o dijagnostičkim tržištima treće generacije (Vaueg 3.0 Hepati-tis C Virus RNA), koji imaju osjetljivost za otkrivanje 520 IU / ml (2500 primjeraka HCV RNA),

    KVANTITATIVNO OTKRIVANJE HCV RNA. Za procjenu koncentracije HCV RNA korištena je kvantitativna verzija PCR. U početku, koncentracija HCV RNA je karakterizirana rednim vrijednostima, kao što su "+", "++" itd., Vizualno odražavajući intenzitet bendova dobivenih elektroforezom produkata amplifikacije ili konačnim postupkom razrjeđivanja, tj. Prisutnošću pozitivnog rezultata u konačnom titracijska točka. Teškoće standardizacije svih faza PCR ne dopuštaju objektivnu procjenu koncentracije HCV RNA, što dovodi do značajnih pogrešaka u interpretaciji dobivenih rezultata.

    Trenutačno, rezultati istraživanja su izraženi u kvantitativnim jedinicama: broj kopija HCV RNA sadržan u 1 ml., U apsolutnim ili logaritamskim terminima (log 10). Na temelju činjenice da koncentracija detektirane HCV RNA odražava broj virusnih čestica, ovaj indikator se naziva "virusni ekvivalent (eq)", uz dodatak prefiksa k (kilogram, tisuću) ili M (milijuna). Drugi način izražavanja količine virusnih čestica je njihov ekvivalent težine. Na primjer, u gramima ili pikogramima (1 pg odgovara približno 1 mil. Eq). Raznolikost upotrijebljenih vrijednosti otežava tumačenje rezultata dobivenih u različitim laboratorijima. Stoga je ekspertni odbor Svjetske zdravstvene organizacije za biološku standardizaciju izradio "međunarodni standardni uzorak" koji sadrži HCV RNA (smrzavanjem sušeni serum koji sadrži HCV RNA prvog genotipa), čija je koncentracija izražena u međunarodnim jedinicama (IU / mL) [47]. Posebni koeficijenti omogućuju izračunavanje dobivenih pokazatelja koncentracije u međunarodnim jedinicama.

    Gotovo sve varijante PCR koriste se za određivanje koncentracije HCV RNA. U tom se slučaju određeni specifični zahtjevi nameću dijagnostičkim pripravcima, od kojih je najvažnije stroga linearnost rezultata, tj. povećanje signala zabilježene reakcije s povećanjem koncentracije HCV RNA u ispitivanom uzorku. Korištenje internih standarda s različitim razinama HCV RNA omogućuje nam izbjegavanje mnogih metodoloških pogrešaka koje mogu utjecati na konačni rezultat reakcije [28]. Osjetljivost primijenjene dijagnostike (Amplicor HCV Monitor v2.0; LCx HCV RNA kvantitativna analiza) omogućuje otkrivanje HCV RNA počevši od 50 kopija po ml [48.49], što je osobito važno za predviđanje učinkovitosti odabrane antivirusne terapije.

    Real-time PCR ("real-time RT PCR") je jedna od najpoželjnijih mogućnosti za kvantitativnu metodu za otkrivanje HCV RNA. Metodu i njegov hardver zajednički su razvili stručnjaci tvrtke Roche i Percin Elmer. Princip metode je sposobnost hidrolize cDNA sekvenci u smjeru 5 '---- 3'. U reakciji se koristi posebna sonda označena s dvije fluorescentne boje koja imaju slične apsorpcijske i fluorescentne maksimume. U prisustvu produkata amplifikacije, Tag polimeraza cijepa sonda, koja sprečava prijenos energije iz jedne molekule boje u drugu i time sprječava oslobađanje kvantne svjetlosti. Poseban instrument bilježi reakciju i matematičko modeliranje fluorescentne kinetike u svakoj fazi reakcije, što omogućuje dobivanje informacija o početnoj koncentraciji HCV RNA.

    Značajka "real-time PCR" je mogućnost dobivanja informacija o prisutnosti HCV RNA izravno u reakcijskom procesu, što omogućuje smanjenje vremena analize u kombinaciji s visokom osjetljivošću i linearnosti rezultata [50]. Prema Tatyana Yashini i koautorima, ova metoda može otkriti 200 kopija HCV RNA po ml. [51].

    Postupci genotipizacije HCV RNA. Definicija HCV-a koja pripada određenom genotipu i podtipovima primijenjena je kako bi se riješili ne samo čisto znanstveni, nego i praktični problemi. Na primjer: traženje izvora zaraze tijekom izbijanja hepatitisa C ili predviđanje učinkovitosti korištene terapije.

    "Zlatni standard" HCV genotipizacije je izravno određivanje primarne strukture HCV RNA s njegovom kasnijom filogenetskom analizom [52], što omogućuje jasno karakteriziranje ovog izolata virusa. Te se informacije mogu dobiti pomoću sljedećih opcija slaganja:

  • izravno;
  • zasnovano na standardnom kloniranju;
  • sekvencioniranje produkata PCR reakcije (ograničeno sekvenciranje).
    Unatoč točnosti rezultata, metoda izravnog sekvenciranja se ne koristi u praktičnoj zdravstvenoj zaštiti zbog tehničkih poteškoća studije i visokih troškova rada. Istodobno, dostupnost informacija o primarnoj strukturi HCV RNA je referentna metoda za genotipizaciju, a dostupnost instrumenata za automatsko sekvenciranje pojednostavljuje dobivanje rezultata.

    Trenutno, u većini slučajeva, metode temeljene na primjeni PCR-a s tip-specifičnim primerima koriste se za genotipiranje HCV RNA. Prvi put genotipizacija HCV RNA izvodi N. Okamoto i koautori u 1992. koristeći RT-PCR [53], koji uključuje dva koraka amplifikacije. Prva od njih provedena je univerzalnim, za sve HCV genotipove, primere, drugi sa smjesom tip-specifičnih primera s dobivanjem specifičnih produkata amplifikacije različitih duljina. Prisutnost određenog genotipa prosuđena je veličinom amplificiranog produkta. Kao početnice koriste se tipske specifične sonde, informacije o kojima se nalazi u 5'UTR, Core ili NS5 - RNVGS regijama [54].

    Hibridizacija amplificiranih produkata s adsorbiranim genskim specifičnim sondama (iz 5'-netranslatirane zone HCV RNA) adsorbiranog na nitroceluloznoj membrani nalazi se pod testom "INNO-LiPA HCV, INNO-GENETIKA" [55]. U početku, koristeći ovaj test, moguće je upisati genotipove: la; lb; 2a; 2b; 3a; 3; 4 i 5a. U budućnosti, ispitni sustavi 2. generacije "INNO-LiPA HCV II, INNOGENETICS" omogućuju nam razlikovanje svih 6 genotipova i dodatno 2c; 2d; 2i; 3c; 4a-h; 6a i 10a. [56]

    Metodološki arsenal za određivanje genotipova HCV nije ograničen na gore navedene postupke i obuhvaća različite metode:

  • genotipizacija na temelju analize restrikcijskih profila amplificiranih proizvoda (RFLP). Proizvodi amplifikacije HCV RNA fragmenata (5'UTR - regije ili NS5 regije HCV RNA) se cijepaju restrikcijskim enzimima. Rezultirajući fragmenti razlikuju se po dužini ovisno o restrikcijskim mjestima unutar njih, koji se cijepaju. Rezultati elektroforeze i njihova usporedba omogućuju nam da identificiramo HCV genotip u uzorku u studiji [57]. Usporedba rezultata genotipiziranja pomoću PCR-RFLP sa sekvenciranjem podataka pokazala je visoku razinu koincidencije rezultata - 95% [58].
  • genotipizacija na temelju SSCP metode (procjena konformacijskog polimorfizma jednostranih DNA fragmenata). Kao predmet studije izabrano je 5'-netranslatirano područje HCV RNA, koja ima minimalni skup nukleotidnih varijacija koje razlikuju genotipove jedna od druge. Ova činjenica određuje mogućnost primjene zajedničkih primera tijekom genotipizacije [59].

    SEROTYPING Anti-HCV omogućen je studijama P.Simmondsa i koautora koji su utvrdili prisutnost protutijela usmjerenih na epitope specifične za genotip, čiji podaci su kodirani NS4 regijom HCV RNA [60]. Uz pomoć dijagnoze za ELISA, napravljenu na osnovi sintetičkih peptida, moguće je razlikovati slučajeve hepatitisa C uzrokovane virusima 1, 2 i 3 genotipova (89% odgovara rezultatima genotipizacije). Razvoj testnih sustava korištenjem sintetičkih i rekombinantnih antigena kodiranih NS4 i Core zona HCV RNA omogućili su nam da proširimo popis vrsta varijanti virusa, kao i da prosudimo prisutnost podtipova (1a, lb, 2a, 2b, 3a, 4a) [61,62]. Trenutno, komercijalna proizvodnja dijagnostičkih proizvoda za serotipiranje provodi se u spot verziji ELISA - "Murekh NA 1-6 Serotyping Assay, Murex Diagnostics", te u varijanti "imunoblot" - RIBA HCV Serotyping Assay, Chiron Diagnostics. Usporedni rezultati rezultata serotipizacije i genotipizacije HCV RNA pokazali su visoku razinu koincidencije, te su dosegnuli 95% [62].

    Serotipizacija anti-HCV u usporedbi s genotipizacijom HCV RNA ima prednosti poput jednostavnosti reakcije i nižih troškova. Istovremeno, ova metoda ni na koji način ne može zamijeniti genotipizaciju. Rezultati serotipizacije anti-HCV upućuju na tip anti-HCV s tekućim ili prethodnim infekcijama. U nekim slučajevima (najčešće u bolesnika s hemofilijom) bilježi se istodobna detekcija anti-HCV različitih podtipova, što može ukazivati ​​na višestruke infekcije s različitim podtipovima i genotipovima HCV-a [63]. Osim toga, u bolesnika s hepatitisom C u pozadini izražene stanja imunodeficijencije, RNA može biti jedini marker, što onemogućuje serotipiranje.

    IDENTIFIKACIJA I LIJEČENJE REZULTATA ISPITIVANJA INFEKCIJE HCV SEROLOŠKIH MARKERA. Prisutnost širokog raspona seroloških markera sadašnje ili prethodne HCV infekcije, kao i moderna metodološka osnova, omogućuju rješavanje mnogih problema laboratorijske dijagnoze i prevencije hepatitisa C. Tablica 2 prikazuje serološke markere HCV infekcije i najvažnija područja njihova ispitivanja.

    Tablica 2
    Dijagnostička značajnost markera tekuće ili prethodne HCV infekcije

    probir
    u službi
    krvi

    potvrđen
    IZJAVE
    rezultat
    + anti-HCV

    Jedan od glavnih zadataka laboratorijske dijagnoze hepatitisa C je dijagnosticiranje i razlikovanje akutnih od kroničnog hepatitisa C identifikacijom seroloških markera infekcije. Kao i kod drugih akutnih virusnih hepatitisa, tijekom infekcije i procesa ozdravljenja konzistentno se pojavljuju i nestaju serološki markeri HCV infekcije (slika 2).

    HCV RNA može se otkriti na dan 7-21 nakon infekcije s HCV i anti-HCV na dan 20-150 (prosječno 50 dana) [64]. Spektar anti-HCV može varirati ovisno o razdoblju akutnog hepatitisa. Vjeruje se da će prvi identificirati protutijela koja su kodirane u Core i NS5 zonama HCV RNA. Anti-HCV na proteine ​​kodirane u NS4 zoni su odsutni u akutnoj fazi hepatitisa C [65]. Usporedno istraživanje koncentracije anti-HCV, spektar anti-HCV i HCV RNA u bolesnika s akutnim i kroničnim hepatitisom pokazao je neke razlike [66]. Prema našem mišljenju, te razlike mogu biti povezane s individualnim karakteristikama infektivnog procesa, što smanjuje njihovu dijagnostičku vrijednost.

    Sl. 2. akutni hepatitis C

    Analogno laboratorijskoj dijagnostici hepatitisa A i B, očekivalo se da bi određivanje antitijela na IgG klase HCV imalo onoliko dijagnostičke vrijednosti kao IgM anti-HAV i IgM anti-HBc. Međutim, testni podaci iz seruma bolesnika s akutnim i kroničnim hepatitisom C za prisutnost anti-HCV IgM ukazuju da se često nalaze među tim pacijentima - 50-93% i 50-70% [67.68], a ti rezultati ukazuju da detekcija IgM anti - HCV se ne može koristiti kao marker akutne HCV infekcije.

    Odsutnost markera koji zahtijeva ulogu "zlatnog" standarda akutnog hepatitisa C određuje potrebu za sveobuhvatnom procjenom dobivenih rezultata na temelju dinamičkog promatranja bolesnika.

    Ne manje važan smjer upotrebe vrlo osjetljivih metoda testiranja HCV RNA smanjuje rizik od razvoja posttransfuzijskog hepatitisa C. Potreba za takvim radom određuje se prisutnošću faze "prozora", tj. vrijeme između prve detekcije HCV RNA i pojave anti-HCV, kao i postojanje donora krvi (pacijenata s kroničnim hepatitisom C) koji imaju HCV RNA u odsustvu anti-HCV. Trenutni sustav praćenja donirane krvi za HCV uključuje samo anti-HCV testiranje i rizik od zaraze hepatitisom C ostaje. Na temelju toga, pitanje testiranja krvi za prisutnost HCV RNA korištenjem suvremenih metoda (NAT metode - "test nuklearnih kiselina") je legitimno. Čimbenik koji ograničava ovo djelo je visoki trošak istraživanja. Da bi se smanjili troškovi, preporučuje se testiranje uzoraka krvnih seruma (od 8 do 96 uzoraka), nakon čega slijedi traženje pozitivnog uzorka u slučaju otkrivanja HCV RNA u skupini seruma. Uzimajući u obzir faktor razrjeđivanja željene HCV RNA kod sjetve seruma seruma, pitanje upotrebe najosjetljivijih metoda detekcije postaje presudno. Vjeruje se da upotreba dijagnostičkih kompleta za NAT - s osjetljivošću od 50-100 IU / mL može znatno smanjiti rizik od poslijetransfuzijskog hepatitisa C.

    Bez sumnje, popis problema koji se mogu riješiti prilikom testiranja cijelog spektra markera HCV infekcije nije ograničen na ta dva područja. Dostupnost suvremenih metoda ispitivanja u kombinaciji s poznavanjem njihovih sposobnosti otvara široke mogućnosti za znanstveni i primijenjeni rad na hepatitisu C.


  • Više Članaka O Jetri

    Ciroza

    Koje ribe imaju opisthorchiasis?

    Opisthorchiasis - teška kormilarna invazija koja utječe na gušteraču, jetru i žučni kanal neke osobe. Infekcija se javlja kada jedete sirove, lagano slane, a ne ispravno toplinski obrađene riječne ribe.
    Ciroza

    Testovi hepatitisa C. Test krvi hepatitisa.

    Da biste saznali je li vaše tijelo izloženo virusu hepatitisa C, dovoljno je napraviti test krvi za hepatitis - biljega infekcije virusom. Ovi markeri su ukupno protutijela na HCV (anti-HCV), koji se određuju ELISA metodom u serumu venske krvi.